Bowen病与鳞状细胞癌细胞凋亡的研究

中华皮肤科杂志 1998年第3期第31卷 论著摘要

作者：郭在培米田耕造冈本佑 之今村贞夫

单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性 病科(郭在培)；日本京都大学皮肤科(米田耕造冈本佑之今村贞夫)

Bowen病(BD)与鳞状细胞癌(SCC)均属于表皮角朊细胞肿瘤。恶性肿瘤常出现细胞周期的异常，而肿瘤细胞分裂与凋亡可能是决定肿瘤生长快慢的重要因素 ［1］。多数BD病变始终局限在表皮内，但约3%～5%的患者可发展成SCC。至今，引起这种临床差异的细胞分子学机理仍不清楚，我们推测可能与细胞凋亡有关，故采用原位特异DNA片段标记方法(TUNEL)对BD和SCC的细胞凋亡进行比较研究，探讨其可能的意义。

一、材料与方法

1.组织标本：4例BD，均为男性，年龄54～73岁；6例SCC，男女各3例；年龄51～82岁。皮肤肿瘤组织均来源于日本京都大学皮肤科，经10%福尔马林液固定、石蜡包埋、组织切片4μm 。作常规HE染

图 1Bowen病表皮中见不规则荧光小体(120×)色，经组织病理确诊。

2.TUNEL染色：组织切片载于经硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)处理的玻片(日本)， 37℃固定24小时。按Mori等［2］的改良方法作凋亡细胞标记。主 要 步骤：切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水后用20μg/ml蛋白酶K(Dako公司)，37℃处理15分钟；然后用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)缓冲液(含30mmol三羟甲基氨基甲烷、140mmol二 甲胂酸钠、1mmol氯化钴)室温下浸浴5分钟；将组织切片用含12.5μmol生物素化dUTP(Boeh ringer Mannheim，德国)，0.15U/μl TdT(Takara公司)的TdT缓冲液，37℃孵育70分钟；再用TB缓冲液(含300mmol氯化钠、30mmol枸橼酸钠)室温下处置15分钟以终止反应。然后，用结合FITC的亲和素(Oncor公司)进行DNA标记，最后用1μg/ml的碘化丙啶(propidium iodi de, PI)作对比染色，荧光显微镜下观察 (Microphot-SA，尼康)。阳性对照采用Oncor 公司提供的断奶4天后的大鼠乳腺切片；

阴性对照采用省略TdT或生物素化dUTP处置的切片。

二、结果

TUNEL染色结果中凋亡细胞采用半定量表示。其中，(++)示凋亡细胞5%，(+)示0%＜凋亡细胞 ≤5%，(-)示凋亡细胞为零；凋亡细胞显示为细胞核着荧光染色。其中，1例BD凋亡细胞为(++)、3例为(+)，6例SCC均为(-)。BD表皮内可见散在大的圆形或卵圆形及不规则的荧光小体 (图1)。此外，多数荧光小体部位与HE染色所示的多核巨细胞及角化不良细胞一致。SCC表皮及侵入真皮组织的非典型角朊细胞中未见阳性荧光细胞。

三、讨论

TUNEL方法是一种原位特异的细胞DNA片段标记方法。由于凋亡时DNA断裂暴露3′-OH末端，在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，生物素化dUTP与其3′-OH末端相连，再经结合荧光素的亲和素反应而呈特异的荧光染色，因此可以直接定位研究组织细胞凋亡。有作者曾对BD 进行超微结构观察发现棘层内有较多细胞呈凋亡细胞的结构改变［3］。本文结果亦显示BD表皮内散在凋亡细胞，并且多与组织病理中的多核巨细胞及角化不 良细胞部位一致，提示这些细胞可能就是凋亡细胞，而Kanerva亦指出某些皮肤病中出现的 角化不良细胞绝大多数以及扁平苔藓病理改变中的Civatte小体均属凋亡细胞［ 4］。本文中，SCC肿瘤组织中未见阳性凋亡细胞。

参考文献

1 Rodriguez-Villanueva J, Mcdonnell TJ. Induction of apop totic cell death in non-melanoma skin cancer by interferon-α. Int J Cancer, 1 995,61∶110-114.

2 Mori C, Nakamura N, Okamoto Y, et al. Cytochemical identification of pr ogrammed cell death in the fusing fetal mouse palate by specific labeling of DNA fragmen tation. Anat Embrylol, 1994,190∶21-28.

3 Kuligowski M, Dabrowski JH, Jblonska S. Apoptosis in Bowen′s Disease: an ultrastructural study. Am J Dermatopathol, 1989,11∶13-21.

4 Kanerva L. Electon microscopic observations of dyskeratosis, apoptosis, colloid bodies and fibrillar degeneration after skin irritation with dithranol. J Cutan Pathol, 1990,17∶37-44.